利用CRISPR技術(shù)建立動(dòng)物基因敲除突變體的實(shí)驗(yàn)流程

(以斑馬魚(yú)基因?yàn)槔?

　　一、基因結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學(xué)分析

　　二、CRISPR 設(shè)計(jì)

　　三、目標(biāo)序列的野生型等位基因的測(cè)序驗(yàn)證

　　3.1 擴(kuò)增目標(biāo)基因組片段的引物設(shè)計(jì)

　　3.2 基因組DNA模板制備

　　以斑馬魚(yú)為例，隨機(jī)選取5枚24 hpf胚胎，以《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》(南京堯順禹生物科技有限公司)制備斑馬魚(yú)基因組DNA模板。

　　3.3 PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序驗(yàn)證

　　四、sgRNA體外表達(dá)模板的制備(質(zhì)粒模板法)

　　本實(shí)驗(yàn)流程以南京堯順禹生物科技公司的二合一質(zhì)粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的質(zhì)粒)質(zhì)粒特征所設(shè)計(jì)。

　　4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)對(duì)的設(shè)計(jì)

　　4.2 向可信賴(lài)的商業(yè)公司訂購(gòu)上述DNA引物(共2條，每個(gè)2 OD，RPC純化即可)。

　　4.3 將正反向兩個(gè)引物進(jìn)行退火

　　4.4 將退火產(chǎn)物與線性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架質(zhì)粒連接

　　4.5 轉(zhuǎn)化

　　4.6 轉(zhuǎn)化子鑒定

　　2%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性克隆應(yīng)出現(xiàn)113 bp的條帶(圖1)：

　　

 

圖1：PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。Lane1：DNA Marker (從下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 陰性轉(zhuǎn)化子; Lane 5-9: 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

　　4.7 測(cè)序驗(yàn)證

　　送2個(gè)經(jīng)PCR驗(yàn)證有陽(yáng)性條帶的菌液去商業(yè)公司測(cè)序，測(cè)序引物為F-sgRNA，確認(rèn)CRISPR序列(去除PAM位點(diǎn))和骨架序列重組到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA質(zhì)粒中;同時(shí)，將同樣的細(xì)菌接種在10 ml含氨芐青霉素的LB管中，37oC條件下?lián)u菌過(guò)夜。

　　4.8 質(zhì)粒抽提

　　4.9 sgRNA模板的制備

　　以上述質(zhì)粒為模板，選用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作為一對(duì)引物，用高保真DNA聚合酶，通過(guò)PCR的方式，進(jìn)行sgRNA模板的制備。

　　五、sgRNA體外轉(zhuǎn)錄

　　用Maxiscript T7 Kit (Ambion)試劑盒，按說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄。

　　說(shuō)明：由于sgRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的是RNA的形式，因而不需要戴帽以及加尾等操作。

　　5.1 20 ml體外轉(zhuǎn)錄體系(依次加入)

　　sgRNA模板：12 ml

　　10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)

　　10mM CTP: 1 ml

　　10mM GTP: 1 ml

　　10mM UTP: 1 ml

　　T7 RNA polymerase：2 ml

　　10 × Transcription Buffer：2 ml (先在室溫下溶解，然后Vortex，再離心后使用)

　　5.2 將上述溶液充分混勻后，離心，然后置于37℃水浴鍋中孵育1h。

　　5.3 向反應(yīng)體系中加入1ml DNase I，混勻，再次于37℃水浴鍋中孵育15min。

　　5.4 向反應(yīng)體系中加80 ml DEPC處理過(guò)的超純水，10 ml 無(wú)RNase的3M醋酸鈉(pH5.2)，渦旋混勻，然后加300 ml 無(wú)RNase的無(wú)水乙醇(購(gòu)買(mǎi)來(lái)未打開(kāi)過(guò)的新的無(wú)水乙醇可視為無(wú)RNase，于-20℃中驟冷1小時(shí)以上。

　　5.5 4℃，12000g 離心20min，棄上清。

　　5.6 以70% 無(wú)RNase的乙醇清洗沉淀，4℃，12000g 離心5min，棄上清。

　　5.7 然后再快速離心，將掛在離心管壁上的液體用移液器小心吸出。

　　5.8 通風(fēng)櫥中(打開(kāi)抽氣開(kāi)關(guān))干燥(20min左右)，若較長(zhǎng)時(shí)間仍不能將沉淀物干燥，再次于4℃，12000g 離心5min，將掛在離心管壁上的液體用移液器(小量程的移液器)小心吸出。

　　5.9 加10 ml DEPC處理超純H2O 溶解沉淀。

　　5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄出的sgRNA條帶的完整性(圖2)，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量轉(zhuǎn)錄出的sgRNA的濃度。

　　5.11 合成出的sgRNA應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分裝，保存在-80oC冰箱中，不要反復(fù)凍融，以免影響其質(zhì)量。

　　

 

圖2、sgRNA (第2條泳道為sgRNA)

　　六、sgRNA活性的測(cè)試

　　將上述sgRNA和Cas9 蛋白混合，顯微注入斑馬魚(yú)受精卵，注射量為1nl。待胚胎發(fā)育至7-24 hpf時(shí)，取5枚胚胎，使用本公司生產(chǎn)的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板，方法同前。

　　然后以引物對(duì)F-gene和R-gene進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物分別亞克隆到pGEM-T Easy載體中。以引物對(duì)T7和Sp6對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增，以篩選驗(yàn)證。

　　對(duì)篩選到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以T7和Sp6擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，F(xiàn)-gene和R-gene再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后，依據(jù)條帶大小，選20個(gè)克隆，5個(gè)一組，PCR產(chǎn)物等量混合后直接送測(cè)序。直接閱讀測(cè)序圖，只要其中任何一組出現(xiàn)有套峰，即假定制備的sgRNA活性不小于5%(1/20)。

　　

 

圖4 典型的測(cè)序套峰圖

　　七、斑馬魚(yú)靶向基因突變體F0代的建立

　　將上述經(jīng)過(guò)驗(yàn)證有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后，按上述相同的方法顯微注入斑馬魚(yú)受精卵。然后將按常規(guī)飼養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至兩月齡時(shí)，剪取尾鰭，按前述同樣的方法進(jìn)行擴(kuò)增目標(biāo)基因組DNA片段。將獲得的PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序，確認(rèn)體細(xì)胞含靶向突變。然后將斑馬魚(yú)飼養(yǎng)至性成熟，共獲得約50尾后代。

　　

 

圖5 典型的體細(xì)胞含靶向突變的測(cè)序套峰圖

　　八、斑馬魚(yú)基因靶向突變F1代的制備

　　收取F0自交的胚胎，獲得不少于100尾以上的F1。將F1按常規(guī)飼養(yǎng)至2個(gè)月時(shí)，選取10尾魚(yú)，剪尾鰭，按前述方法進(jìn)行基因型鑒定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用南京堯順禹生物科技有限公司的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板，再以引物對(duì)F-gene和R-gene進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序，通過(guò)直接讀測(cè)序的色譜圖，確認(rèn)每一位魚(yú)是否攜帶等位基因突變。

　　九、基因靶向突變體的擴(kuò)群建系

　　將攜帶基因靶向突變的F1突變體和野生型交配，獲得F2群，完成基因靶向突變體的建系擴(kuò)群。